Validation of ic-ELISA: low-cost immunoassay developed for aflatoxin analysis in egg
A aflatoxina é um contaminante tóxico perigoso em alimentos e rações, com perdas freqüentes na produção animal. Um ELISA competitivo indireto de baixo custo (ic-ELISA) foi desenvolvido usando anticorpo monoclonal (mAb) produzido in vitro pelo cultivo da cepa de hibridoma AF4 (produtor de mAb altamente específico que reage 100% com aflatoxina AFB1). Este imunoensaio foi validado como uma promissora imunotécnica rápida, sensível e simples para a triagem de aflatoxina em ovo. O ic-ELISA validado internamente com limite de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) de 0,35 µg kg-1 e 0,71 µg kg-1, respectivamente, e R2> 0,99 mostrou-se mais sensível do que os métodos oficiais de alto custo, e também aumentou o padrão de detecção para amostras contaminadas de nível inferior. O ic-ELISA validado utilizou concentração baixíssima do reagente principal, o mAb (1,5 mg mL-1, título 1: 30.000), reduzindo o custo, e alcançou interferência da matriz inferior a 10% para o substrato de ovo. A taxa média de recuperação foi de 98% em ovo, aumentando AFB1 de 1,0 a 5,0 µg kg-1 nas amostras. A precisão foi expressa por repetibilidade e precisão intermediária, ambas com desvios padrão relativos abaixo de 15%. Este ensaio validado intralaboratorialmente foi aplicado para avaliar a contaminação por aflatoxina em ovos de dois grandes produtores locais. AFB1 foi detectado em 8% das amostras do produtor A com nível médio de 0,84 µg kg-1, enquanto o produtor B apresentou contaminação em 15% das amostras, com nível médio de 0,94 µg kg-1. Esse monitoramento reduziu o custo da análise em aproximadamente 70 vezes, quando comparado aos kits comerciais. Indicou também baixa ocorrência e baixo nível de contaminação, sem qualquer deformação visual no ovo, no que se refere à avaliação da qualidade. Tal imunoensaio de alta sensibilidade seria crucial para garantir um controle de aflatoxina de amplo alcance por meio de rastreamento confiável em países em desenvolvimento e, sucessivamente, fornecer ovos sem risco para os consumidores.
Validation of ic-ELISA: low-cost immunoassay developed for aflatoxin analysis in egg
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DOI: 10.22533/at.ed.0202123084
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Palavras-chave: imunoensaio, anticorpo monoclonal, aflatoxina, aves, validação
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Keywords: immunoassay, monoclonal antibody, aflatoxin, poultry, validation
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Abstract:
Aflatoxin is a hazardous toxic contaminant in food and feed, with frequent losses in animal production. A low cost indirect competitive ELISA (ic-ELISA) was developed using monoclonal antibody (mAb) produced in vitro by cultivation of hybridoma strain AF4 (highly specific mAb producer which react 100% with aflatoxin AFB1). This immunoassay was validated as a promising rapid, sensitive and simple immunotechnique for aflatoxin screening in egg. The in-house validated ic-ELISA with limit of detection (LOD) and quantification (LOQ) of 0.35 µg kg-1 and 0.71 µg kg-1, respectively, and R2 >0.99 showed more sensitive than official high cost methods, and it also increased the detection pattern for lower level contaminated samples. The validated ic-ELISA used a very low concentration of main reagent, the mAb (1.5 mg mL-1, titer of 1:30,000), reducing the cost, and it reached matrix interference lower than 10% for egg substrate. Mean recovery rate was 98% in egg, spiking AFB1 from 1.0 to 5.0 µg kg-1 in samples. Precision was expressed by repeatability and intermediate precision, both with relative standard deviations below 15%. This intra laboratory validated assay was applied to evaluate aflatoxin contamination in egg of two large-scale local producers. AFB1 was detected in 8 % samples from producer A with mean level of 0.84 µg kg-1, while producer B showed contamination in 15 % samples, with mean level of 0.94 µg kg-1. This monitoring reduced the analysis cost by approximately 70-folds, when compared with commercial kits. It also indicated low occurrence as well as low contamination level, without any visual deformation in egg, concerning quality evaluation. Such high sensitive immunoassay would be crucial to assure a wide-range aflatoxin control through reliable tracking in developing country, and successively provide risk-free egg for consumers.
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Número de páginas: 25
- Lívia Montanheiro Médici Zanin
- Thaís Marques Amorim
- Fernando de Godoi Silva
- Fabiana Akemi Hirata Bae
- Giovana dos Santos Marcolino
- André Ribeiro da Silva
- Mariana Ribeiro Benfatti
- Angélica Tieme Ishikawa
- Cássia Reika Takabayashi Yamashita
- Daiane Dias Lopes
- Elisabete Yurie Sataque Ono
- Eiko Nakagawa Itano
- Osamu Kawamura
- Elisa Yoko Hirooka
