Avaliação da Integridade do cfDNA através de qPCR com os primers L1PA2
A presença de DNA livre de células (cfDNA) no plasma foi constatada em
1948, desde então, explora-se a sua utilização como um biomarcador de processos
patológicos, pois o cfDNA origina-se, principalmente, da apoptose, gerando
fragmentos curtos, ou da necrose, gerando fragmentos longos. A diferença nos
tamanhos de fragmentos pode ser utilizada para avaliar a integridade do cfDNA (intcfDNA).
Dessa forma, o objetivo do trabalho foi desenvolver um método de
determinação da int-cfDNA em amostras de 14 indivíduos saudáveis, através de
qPCR utilizando os primers L1PA2. Duas etapas de centrifugação foram executadas
para obtenção do plasma, do qual isolou-se o cfDNA com um método de colunas. O
cfDNA isolado foi submetido à qPCR utilizando-se dois conjuntos de primers L1PA2,
um para fragmentos curtos de 90pb e outro para fragmentos longos de 222pb. Para
a quantificação foram feitas duas curvas padrão a partir de um pool de cfDNA de 10
amostras de indivíduos normais. A eficiência da curva de L1PA2 90pb foi de 100%,
com coeficiente de determinação (r²) de 0,98 e para L1PA2 222pb foi de 99%, com
r²=0,97. A int-cfDNA média foi de 0,64±0,28; IC95%(0,45-0,83). Os resultados
apontam que a qPCR com os primers L1PA2 pode ser utilizada na investigação de
estados patológicos relacionadas com morte celular. No entanto, é necessário
explorar a relação da integridade com os processos de origem desses fragmentos
para determinar os limites entre o estado normal e alterado, e com isso validar a
metodologia de biópsia líquida para o diagnóstico e prognóstico em situações
patológicas.
Avaliação da Integridade do cfDNA através de qPCR com os primers L1PA2
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Palavras-chave: cfDNA, integridade do cfDNA, biópsia líquida, qPCR.
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Keywords: cfDNA, cfDNA integrity, liquid biopsy, qPCR.
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Abstract:
The presence of cell-free DNA (cfDNA) in plasma was first found in 1948
and, since then, it’s utilization as a biomarker in pathologic processes, because
cfDNA is originated, mainly, from apoptosis, generating short fragments, or from
necrosis, generating long fragments. The diference in the size of the fragments can
be used to evaluate the integrity of cfDNA (int-cfDNA).This way, the objective of this
study was develop a method of int-cfDNA determination in 14 healthy individuals,
using qPCR with L1PA2 primers. Two centrifugation steps were made to obtain
plasma samples, from which cfDNA was isolated with a column method. The isolated
cfDNA was submeted to qPCR using two sets of L1PA2 primers, one for short
fragments with 90 bp and another for long fragments with 222 bp. Two standard
curves made from a pool of cfDNA of 10 samples of healthy individuals were used to
the quantification of the fragments. The efficiency of L1PA2 90 bp curve was 100%,
with determination coefficient (r²) equal to 0,98 and for L1PA 222 bp was 99%, with
r²=0,97. The mean int-CFDNA was 0,64±0,28; IC95%(0,45-0,83). The results points
that the qPCR with L1PA2 primers can be used in the investigation of pathologic
processes related to celular death. However, it’s necessary to explore the relation of
the intregrity with the origin processes of this fragments to determine the limits
between the normal and altered state. This way, the liquid biopsy methodology can
be validated to the diagnostic and prognostic in pathologic situations.
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Número de páginas: 15
- Luzinete Araújo Nepumoceno
