PRUEBA DE NEUTRALIZACIÓN POR REDUCCIÓN DE PLACAS EN UN SISTEMA SIN INYECCIÓN DE CO2 PARA LA EVALUACIÓN UN TIPO SILVESTRE DE VIRUS DENGUE SEROTIPO 2
El dengue es la arbovirosis más importante en la salud pública en todo el mundo, cuyo serotipo 2 (DENV-2) está asociado con grandes brotes en muchas regiones del Perú. La Prueba de Neutralización por Reducción de Placas (PRNT) se considera el "estándar de oro" en la detección de anticuerpos neutralizantes contra DENV, esta prueba utiliza incubadoras con inyectores de CO2 para el proceso; Sin embargo, es difícil de adquirir, lo que aumenta el costo en materiales y equipos. Además, algunas cepas de DENV de tipo salvaje son difíciles de plaquear, siendo necesario optimizar el PRNT para estudios de seroprevalencia con cepas autóctonas. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue optimizar el PRNT utilizando un sistema sin inyección CO2 para una cepa viral de tipo salvaje de DENV-2. La cepa DENV-2 aislada en la línea celular C6/36 HT y confirmada por Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR), se propagó a través de 5 pasajes en la línea celular Vero-76. Se evaluaron tres concentraciones de células: 1,5 x 105 células/ml, 2,0 x 105 células/ml y 2,5 x 105 células Vero/ml en placas de 24 pocillos. Adicionalmente, el medio de crecimiento se ajustó a 3 medidas de pH diferentes (pH: 6.5, pH: 6.9 y pH: 7.2) usando HEPES para evitar la alcalinización del medio. Luego, las placas se sellaron y se incubaron a 37 ° C sin CO2 durante 9 días. Posteriormente, el ensayo en placa se realizó inoculando una dilución en serie de 10 veces del stock viral en placas de 24 pocillos con células Vero-76 aplicando el método semisólido con monocapa preformada (con 3 horas de adherencia viral) y adición del medio de recubrimiento con 3 % de carboximetilcelulosa (CMC) y aplicando el método semisólido con células en suspensión (con 4 horas de adherencia viral) y adición de medio de recubrimiento con 3%, 4% y 6% de CMC, sin CO2 hasta el día de tinción con Azul Negro de Naftol. Una vez que se obtuvo la concentración óptima de células, el pH y el día de tinción adecuados, el PRNT se llevó a cabo utilizando 5 sueros seronegativos para el virus de la fiebre amarilla (YFV) y sin reporte de dengue, diluido en 1:5, 1:10 y 1:20; 5 sueros seropositivos a YFV por PRNT y sin reporte de dengue, diluido en 1:5, 1:10 y 1:20; y 5 sueros con reporte de dengue diluido en 1:160; 1:320 y 1:640. Como resultado, el Ensayo de Placas con células en monocapa produjo placas indefinidas y no contables. Usando células Vero-76 en suspensión a 2.5 x 105 células/ml, con el medio de crecimiento ajustado a pH: 6,9, recubrimiento con CMC al 6%, dio como resultado, en el octavo día, placas definidas de 2 mm de diámetro aproximadamente, revelando un título viral de 1.2x106 UFP/ml. Los sueros con reportes de dengue fueron positivos para neutralización de DENV-2 (reducción del número de placas superior al 70%) en diluciones desde 1:160 a 1:640. Los sueros positivos a YFV no mostraron reacción cruzada en ninguna dilución. En conclusión, la PRNT, aplicando el método semisólido con células en suspensión y usando una incubadora sin inyector de CO2, permitió detectar anticuerpos neutralizantes contra la cepa de tipo salvaje de DENV-2 y no mostró reacción cruzada con YFV en diluciones mayores a 1:5.
PRUEBA DE NEUTRALIZACIÓN POR REDUCCIÓN DE PLACAS EN UN SISTEMA SIN INYECCIÓN DE CO2 PARA LA EVALUACIÓN UN TIPO SILVESTRE DE VIRUS DENGUE SEROTIPO 2
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DOI: 10.22533/at.ed.47820130326
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Palavras-chave: PRNT, Dengue Virus -2, Virus de Fiebre Amarilla, Dióxido de Carbono, Cultivo Celular.
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Keywords: PRNT, Dengue Virus-2, Yellow Fever Virus, Carbon Dioxide, Cell Culture
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Abstract:
Dengue is the most important arbovirosis in public health worldwide, which serotype 2 (DENV-2) is associated with large outbreaks in many regions of Peru. The plaque reduction neutralization test (PRNT) is considered the "gold standard" in the detection of neutralizing antibodies against DENV, this test uses incubators with CO2 injectors for the process; however, is hard to acquire, which increase the cost in materials and equipment. In addition, some wild-type DENV strains are difficult to plaque being necessary to optimize the PRNT for seroprevalence studies with autochthonous strains. Therefore, the objective of this study was to optimize the PRNT using a non- CO2 system for a wild type strain of DENV-2. The DENV-2 strain isolated in the C6/36 HT cell line and confirmed by PCR was propagated through 5 passages in the Vero-76 cell line. Three cell concentrations: 1,5 x 105 Vero cells/ml, 2,0 x 105 Vero cells/ml and 2,5 x 105 Vero cells/ml were evaluated in 24-well plates. Thus, 3 different pH adjustments of growth medium were performed (pH: 6.5, pH: 6.9 and pH: 7.2) using hepes to avoid alkalinization of the medium. Then, the plates were sealed and incubated at 37 °C without CO2 for 9 days. Subsequently, the plaque assay was performed inoculating 10-fold serial dilution of viral stock on 24-well plates with Vero-76 cells applying the semi-solid method with pre-formed monolayer (with 3 hours of viral adherence and addition of overlayer with 3% of carboxymethylcellulose (CMC)) and applying the semi-solid method with cells in suspension (with 4 hours of viral adherence and addition of 3%, 4%, and 6% CMC), the plates were sealed and incubated at 37 ° C without CO2 until the staining day with Naphthol blue black. Once the optimal concentration of cells, pH and staining day were obtained, the PRNT was performed using 5 sera seronegative to yellow fever virus (YFV) and without reports of dengue diluted in 1: 5, 1:10, 1:20; 5 sera seropositive to YFV by PRNT and without reports of dengue diluted in 1: 5, 1:10, 1:20 and 5 sera with reports of dengue diluted in 1: 160; 1: 320 and 1: 640. As results, the plaque assay with monolayer cells produced undefined and non-countable plaques. Using Vero-76 cells in suspension at 2,5 x 10 5 cells / ml, with the growth medium adjusted to pH: 6.9, overlayer with 6% CMC as results defined plaques of diameter 2 mm approximately on the eighth day and a viral titer of 1.2 x 106 PFU/ml were obtained. Sera with reports of dengue were positive for DENV-2 (plaque reduction greater than 70%) at dilutions: 1: 160 to 1: 640. YFV positive sera did not show cross-reaction at any dilution. In conclusion, the PRNT, applying the semisolid method with cells in suspension and using an incubator without CO2 injector, allows to detect neutralizing antibodies against the wild type strain of DENV-2 and does not show cross-react with YFV at a dilution of 1: 5 to more.
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Número de páginas: 10
- SEVILLA DROZDEK LUCAS AUGUSTO
- MAMANI ZAPANA ENRIQUE WALTER
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- VASQUEZ CAJACHAHUA KARLA VERONICA
- BERNARDO ESTEBAN QUISPE BRAVO
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