CRIOPRESERVAÇÃO DAS CÉLULAS TUMORAIS DE EHRLICH
O tumor de Ehrlich é uma neoplasia experimental de camundongos transplantável espécie-específica e mantida através de repiques em animais vivos no biotério da Universidade Metodista de São Paulo. O projeto para criopreservação das células tumorais de Ehrlich pretende diminuir o uso de animais vivos utilizados para a manutenção dessas células.
O experimento foi submetido e aprovado na CEUA-Metodista n° 189/17. As células do tumor de Ehrlich foram i njetadas em um camundongo receptor por via i ntraperitoneal e após 7 dias o l íquido ascítico foi aspirado. Cerca de 200μL deste l íquido foi acrescido cada crioprotetor (200μL DMSO ou 100μL DMSO+100μL glicerol ou 200μL de glicerol) e 600μL de RPMI e mantidos em congelamento por 20 e 40 dias. Realizou-se descongelamento em banho Maria a 37°C por 5 minutos. Em um tubo cônico graduado, adicionou-se 7mL de RPMI ao conteúdo da amostra e para posterior centrifugação a 200 rpm. Avaliou-se a viabilidade das células em solução de Azul de Trypan. Na sequência inoculou-se 0,3 ml desta solução em 6 animais. Acompanhou-se o desenvolvimento do tumor nestes animais por 14 dias.
A análise da viabilidade celular no grupo mantido por 20 dias de congelamento revelou os seguintes percentuais de células viáveis: DMSO 33%, DMSO+glicerol 0% e glicerol 0,79%. Após 14 dias, observou-se crescimento tumoral apenas em um camundongo de cada amostra. Após 40 dias de congelamento, realizou-se o mesmo procedimento e constatou-se as seguintes porcentagens de células viáveis: DMSO 23,61%, DMSO+glicerol 8,71% e glicerol 2,11%. Neste grupo, após 14 dias não foi observado crescimento tumoral nos camundongos.
Houve grande variação na viabilidade das células nos diversos protocolos e nos dois tempos experimentais. Entretanto, a criopreservação mostrou-se mais eficiente no grupo somente DMSO atingindo 33% e 23,61% em 20 e 40 dias, respectivamente. O crescimento in vivo após o congelamento somente foi observado aos 20 dias. Há necessidade de se aprimorar tal protocolo para que haja um aumento na viabilidade celular e posterior aplicação como criopreservação.
CRIOPRESERVAÇÃO DAS CÉLULAS TUMORAIS DE EHRLICH
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DOI: 10.22533/at.ed.2652024073
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Palavras-chave: Tumor de Ehrlich, criopreservação, DMSO, glicerol, viabilidade de células, nitrogênio líquido.
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Keywords: Ehrlich tumor, cryopreservation, DMSO, glycerol, cell viability, liquid nitrogen.
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Abstract:
The Ehrlich tumor is an experimental transplantable species-specific mouse neoplasm and its viability is currently possible through cell splitting in live animals at the vivarium of Universidade Metodista de São Paulo. The cryopreservation of Ehrlich tumor cells aims reducing the use of live animals in order to maintain the viability of these cells.
The experiment was submitted and approved by CEUA-Metodista n° 189/17. Intraperitoneal injection of Ehrlich tumor cells was administered in receptor mice and ascitic fluid was collected after 7 days. About 200μL of this fluid was added to each cryoprotectant (200μL DMSO or 100μL DMSO+100μL glycerol or 200μL of glycerol) and 600μL of RPMI and the resulting compound was kept frozen for 20 and 40 days. The frozen cells were then thawed in a 37°C water bath for 5 minutes. The sample was added to a graduated tube with 7mL of RPMI. The mix was placed in a centrifuge with a speed setting of 200 rpm. Cell viability was evaluated by adding a Trypan Blue solution. Subsequently 0.3mL of this solution was inoculated into 6 animals. Tumor development in these animals was followed for 14 days.
The following cell viability was found after analyzing the group of cells that were frozen for 20 days: DMSO 33%, DMSO+glycerol 0% e glycerol 0.79%. After 14 days of inoculation tumor growth was observed in only one of the mice of each sample. The procedure was repeated with the group of cells that were frozen for 40 days and the following cell viability was found: DMSO 23.61%, DMSO+glycerol 8.71% and glycerol 2.11%. After 14 days of inoculation no tumor growth was found in any of the mice.
There was a considering variation of the cell viability when different protocols were used and when they were exposed to different times of cryopreservation. However, cryopreservation of cells was more efficient when only DMSO was used, with an efficiency percentage of 33% and 23.61% after 20 and 40 days respectively. Tumor growth in vivo was observed in cells that were frozen for 20 days only. It is necessary to enhance this procedure in order to increase the cell viability and use it for cryopreservation in future research.
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Número de páginas: 15
- Silvia Regina Kleeb
- Carlos Pereira Araújo de Melo
- Beatriz Tessaroto Buscarino
