AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS CULTURA-INDEPENDENTES PARA IDENTIFICAÇÃO DE Staphylococcus aureus CAUSADOR DE MASTITE SUBCLÍNICA POR MALDI-TOF MS
A mastite subclínica é uma doença que ocasiona redução na produção do leite, devido à elevada contagem de células somáticas. Além disso, casos de MS estão associados com a deterioração da qualidade do leite, como por exemplo a diminuição da percentagem de proteína verdadeira e lactose. A espectrometria de massas tem se mostrado uma boa alternativa para análises de identificação de bactérias mais rápidas nos laboratórios de diagnósticos de rotina. O estudo objetivou a avaliação de diferentes protocolos cultura-independentes (direto do leite) para identificação de Staphylococcus aureus causador de mastite subclínica por MALDI-TOF MS. Amostra composta de leite oriunda de caso de mastite subclínica (CCS> 200×103cels/mL) e cultura positiva para S. aureus (CBT> 10 UFC/mL) foi selecionada para a avaliação dos protocolos de identificação por MALDI-TOF MS. Dez protocolos foram avaliados apresentando diferenças na etapa de disruptura celular. Brevemente, 400 µL de leite foram centrifugados por 1 min à 13000 rpm. O pellet foi ressuspendido em 200 µL de TE ou PBS e submetido a centrifugação, em seguida foi lavado e transferido para microtubo contendo beads de zircônia ou granada. O microtubo foi alocado em disruptor para extração das proteínas ribossomais bacterianas. Por fim, 1 µL do extrato foi aplicado no spot da placa MALDI-TOF seguido da aplicação de 1 µL ácido fórmico 70% e 1 µL de matriz HCCA. A leitura da placa foi realizada de acordo com as especificações para identificação, e o processamento por meio do software MALDI Biotyper 4.1.70. A técnica possibilitou a identificação de Staphylococcus aureus direto de amostras de leite quando adotado protocolo de extração de proteínas ribossomais utilizando para lavagem da amostra solução de PBS, associado a disruptura celular. Portanto, comparado a metodologia convencional, é possível a obtenção de diagnóstico rápido (após 4 h) e confiável (escore >1.8), sem a necessidade de cultura microbiológica.
AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS CULTURA-INDEPENDENTES PARA IDENTIFICAÇÃO DE Staphylococcus aureus CAUSADOR DE MASTITE SUBCLÍNICA POR MALDI-TOF MS
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DOI: 10.22533/at.ed.8412003064
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Palavras-chave: cultura-independente, qualidade, leite, espectrometria.
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Keywords: non-culture-based, quality, milk, spectrometry.
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Abstract:
Mastitis is one of the most common diseases of dairy cattle. The majority of mastitis is of bacterial origin. Bacterial infections affect the yield of total milk and milk component causing severe economic losses. However, the identification of mastitis-causing bacteria by means of conventional microbiology can take from 2 to 7 days for the complete diagnosis at the species level. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) has been utilized as a rapid and precise identification. In this context, the current study aimed to compare ten non-culture-based protocols (direct from milk samples) for identification of Staphylococcus aureus by MALDI. A milk composite sample obtained from one subclinical mastitis case (CCS> 200×103 cels/mL) with culture-positive result for Staphylococcus aureus (CBT> 10 UFC/mL) was selected. Briefly, 400 µL of milk were centrifuged. The pellet was resuspended and an extra centrifugation step was performed. After that, the pellet was washed and transferred to a microtube containing beads. Then, the microtube was allocated in a disruptor for extraction of bacterial ribosomal proteins and different aliquots (for the same sample) were subjected to different protocols. Lastly, 1 µL of the extract was applied to the MALDI plate, followed by the application of 1 µL of formic acid (70%) and 1 µL of HCCA matrix. The analysis was performed according to the standard specifications and the processing was done using the MALDI Biotyper 4.1.70 computer software adopting sepsityper mode with score > 1.8 for identification at the species level. It was possible to obtain identification of Staphylococcus aureus direct from milk samples when using the cell disruption protocol with 3 zirconium beads at 3,000 rpm for 2 cycles of 60s combined with MALDI-TOF MS. Besides, it is possible to obtain a reliable (score >1.8) and a rapid diagnose (after 4 h) in comparison with conventional microbiology.
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Número de páginas: 10
- Carlos Eduardo Fidelis
- Letícia Cassano Rodrigues de Abreu
- Marcos Veiga dos Santos
- Juliano Leonel Gonçalves
- Manoela Franke
